TPS酶免试剂盒说明书

                                  TPSäELISA

                            96孔(12x8)                                                             1998.5

用途

TPSäELISA 是一种酶标免疫试剂，用以定量检测血清（或其他体液）中细胞角蛋白18具有M3-抗原决定簇的可溶性片段。

简介

再大部分上皮细胞中，细胞角蛋白中间纤维蛋白参与构成了细胞骨架。细胞角蛋白可分为酸性、中性和碱性蛋白，其分子量40-70kDa。细胞角蛋白18是一种分子量为45kDa的酸性蛋白，在一般上皮细胞中与细胞角蛋白8形成异构二聚体复合物。免疫组化发现正常肝细胞、胰腺导管、大部分内分泌细胞、近端肾小管、甲状腺、尿道和女性生殖道都存在细胞角蛋白18。但是上皮细胞来源的恶性肿瘤和转移瘤高度表达细胞角蛋白18。但是上皮细胞来源的恶性肿瘤和转移瘤高度表达细胞角蛋白18.

M3单克隆抗体是TPS™试剂盒的主要成分.此抗体是以HeLa细胞株作为抗原制备的.

蛋白序列分析和cDNA基因克隆出的M3抗原决定簇结构显示M3抗体的结合位点在人类细胞角蛋白18的DNA螺旋第二圈.

采用M3单克隆抗体做检测抗体TPS™可定量检测癌症患者血清中的细胞角蛋白18片段上的M3-抗原决定簇.

一般认为上皮细胞来源的恶性肿瘤,包括转移瘤所表达的细胞角蛋白18在总体上代表着至少一部分细胞原始形态.部分恶性肿瘤所表达的量与正常组织相差很大.TPS™血清水平不是简单反映肿瘤体积而主要是反映肿瘤细胞的活动状态.有时体积很小的肿瘤,TPS™的水平很高;肿瘤很大的,TPS™值并非升的很高.这其中的生物学奥秘上不大清楚.

癌症患者的血清/尿液的临床研究已经证实TPS™对于病人的治疗,监测,预后都是非常有用的,尤其是乳腺癌,卵巢癌,胃肠癌,前列腺癌,肺癌和膀胱癌.

妊娠,肝脏疾患,肾衰,感染,糖尿病均可导致TPS™值升高.届时如怀疑病人有感染,可以两周后重复检测.

实验原理

TPS™ ELISA是一种固相、双为点夹心免疫试剂.试剂盒内的酶标板为多克隆抗体包被,可直接与细胞角蛋白反应的这种抗体与病人标本所含的细胞角蛋白18(CK18)片段发生反应,同时再以辣根过氧化酶(HRP)标记的M3单抗做示踪抗体.

Fig.1     TPS™    实验原理
 

 
遵照如上夹心模式,固相/TPS™/标记的抗体,在洗板步骤后,未结合的多余的示踪抗体被去掉.加入TMB 底物,孵育后反应结束.最后在酶标仪450nm读光吸收值.根据以知的TPS™ 标准液浓度值和实测的相应的光吸收值绘制标准曲线,病人标本TPS™浓度值可以从曲线上得出.TPS™浓度值的表达是: 单位/升(U/L)

注意事项

1.     TPS™ ELISA  试剂盒仅用于体外.

2.     成分中含1,2-苯并噻唑啉-3-(Procel)防腐。

3.     终止液含硫酸，注意避免灼伤。

4.     不要使用过期试剂。

5.     不要混用不同批号试剂盒内的试剂。

6.     残留试剂和病人标本（视同其他潜在污染性标本）请按实验室规章制度处理。

试剂和患者标本应远离餐饮、吸烟和化妆品。试剂用后及时盖好。

储存

2-8°C，禁止冰冻！

铝袋中的TPS™酶标板需保持干燥，不要丢弃袋中的干燥剂。

TMB底物和HRP标记的抗TPS™示踪液对光和金属离子敏感，需保持在原来的棕色瓶中，并始终保存在2-8°C条件下。

操作前所有试剂需恢复至室温（20±4°C）。

标本采集与制备

1． 建议检测血清标本。病人不必空腹采血，采血前无特殊要求。血清量要充足，2x50µL，（双孔）。静脉采血 时要避免溶血，管内不需抗凝，分离血清。

2． 如检测将在48小时内进行，血清标本可置于2-8°C冰箱中，否则应分量后置于-20°C。冰冻标本应在融化后轻轻摇匀。冰冻标本只许融化一次，在20±4°C条件下一小时内完成。

3． 避免采用脂血、溶血及受污染的标本。

4． TPS™ ELISA试剂和常规检测最高限值为1200U/L。超过此次浓度值的标本应用TPS™稀释液稀释后检测。计算TPS™值时不要忘记乘以稀释系数。

试剂盒内容

1． TPS™包被的微孔酶标板

酶标板（已干燥）为8孔x12，由细胞角蛋白的马多克隆抗体所包被并由塑料垂片覆盖。酶标板密封于铝箔袋中，袋中含有干燥剂。若酶标板一次未全部用完，可将剩余的继续封存于袋中，袋中需保持有干燥剂。剩余的酶标板可继续使用。

2． TPS™ HRP抗TPS示踪液

每小瓶含0.6mL被辣根过氧酶（HRP）标记的鼠源抗TPS单抗，溶液为含血清蛋白稳定剂的磷酸缓冲液。示踪液应用TPS™示踪稀释缓冲液按16倍稀释（见表1）。注意！示踪液是浓缩液！要避光！

3． TPS™示踪液稀释缓冲液

每小瓶含8mL磷酸缓冲液，其中含血清蛋白稳定剂。用于稀释TPS™ HRP抗TPS示踪液。液体所呈现的蓝色是为了易于辨认。

4． TPS™稀释液

每小瓶含6mL小牛血清磷酸缓冲液。液体呈现出的黄色是为了易于辨认

5． TPS™A-D标准液

   TPS™标准液4瓶，每瓶1mL。黄色是为了易于辨认。标准液A-D的浓度值分别为30，

   120，600和1200U/L。

6． TPS™质控

高于浓度质控分别为365±40U/L和90±10U/L，液体为黄色易于辨认，每瓶1mL的质控是TPS™反应物质溶于小牛血清磷酸缓冲液。

7． TPS™TMB底物溶液    1瓶

含35mL TMB (3,3´5,5´-四甲基联苯胺)。备用。

8．TPS™终止液   1瓶

   含12mL4.9%硫酸。备用。注意避免灼伤！

9．TPS™冲洗液溶质片剂  2片

   每1片可溶于500mL蒸馏水。溶解后的冲洗液为10mM磷酸缓冲液(pH7.4)，含0.14M            NaCl，3mM KCl和0.05%Tween20。

10．TPS™ ELISA试剂盒说明书

11．TPS™证书。

注意！试剂2-6含0.01%Proxel防腐。

表1  TPS™ HRP抗TPS示踪液稀释比例

本试剂盒未提供的某些必要品

1．50µL和100µL的微量加样器，可加样50µL和200µL的8 道微量加样器。

2．孵育用的酶标板震荡器，中度到强度为宜。

3．洗板装置。

4．450nm酶标仪。

应客户要求可提供TPS™ ELISA稀释液，25mL/瓶。

操作步骤

操作前将所有试剂和病人标本恢复到室温，实验应在室温下（20±4°C）进行。

1． 根据标准液，质控和患者标本量所确定的酶标板条数。

2． 准备TPS™ HRP抗TPS示踪溶液。

根据所需要的量按比例用TPS™示踪稀释缓冲液稀释TPS™HRP抗示踪液。（见表1）

注意：配制的TPS™HRP抗TPS示踪溶液在12小时内有效。

3． 按照自己对酶标板的安排顺序加入标准液、质控、病人标本，加样量为50µL。

4． 马上加入实际TPS™HRP抗TPS示踪溶液，每孔50µL。

孵育

5． 振荡孵育2小时，振荡为中度到强度。

显色

6． 准备冲洗液：用500mL新鲜的蒸馏水溶解1片浓缩冲洗液的溶质片剂。

7． 吸净孔内孵育液并连续用冲洗液洗板6遍。

8． 每孔加入TPS™TMB底物溶液200µL，避光孵育20±1分钟（最好在暗环境中。

9． 每孔加50µLTPS™终止液。为确保底物和终止液的完全混合，可在振荡器上振荡5-10秒。5分钟后读值。

读值

10.在450nm酶标仪上读值。

11.手工或用计算机内存程序计算结果。

计算结果

计算机内存程序计算：

可按表2先输入稀释液（代表0值）、标准液A、B、C、D的浓度值（U/L），读值后计算机即可在类似图3的曲线上显示出质控和病人标本的光吸收值和浓度值。（log-log）

表2  结果显示

图3  标准曲线示例：log-log

计算机程序中计算方法的选择：

平滑样条函数法(Spline smoothed)或回归值计算方法(Linearregression)均可。

X轴：TPS™浓度值（U/L），log计算法。

Y轴：450nm光吸收值，log计算法。

手工计算方法

TPS™ELISA标准曲线可以在log-log坐标纸上手工绘制。相对于X轴上的各标准液浓度值点出各自的光吸收值(450nm)，通过这些点连接出标准曲线。

根据所测的光吸收值从绘制的标准曲线上读出病人的TPS™浓度值。如果标本是稀释后再检测的，所得的浓度值必须乘以稀释系数。

X轴：TPS™浓度值（U/L），log 计算法。

Y轴：450nm光吸收值，log计算法。

检测范围

30-1200U/L

精确度

批内CV（%）2.9-6.8

批间CV（%）1.6-6.5

特异性

TPS™ELISA试剂盒所采用的单克隆抗体对于TPS™是特异性的，与病人标本中可能存在的其他肿瘤相关抗原无交叉反应。

界值

195例健康者的检测结果显示95%的健康者<80U/L。

由于人群、实验操作技术、临床对照组选择的不同，不同的实验室和不同的地区应采取类似的方法建立自己的正常参考值。

倒钩效应

TPS™ELISA试剂盒的检测范围为30-1200U/L。高于此上限的标本应在检测前适当稀释。（见标本采集与制备）浓度值高达20000U/L无倒钩效应。

敏感性

最低检测限度为6U/L。此值来自TPS™稀释液两个浓度值的标准差。

回收率

用正常人血清稀释的各种浓度的TPS™标本经检测计算其回收率为95-107%。

稀释方法与检测结果

用TPS™稀释液分别连续稀释三种含高浓度TPS™的血清标本并重复使用4次检测。

不同检测方法的相关性

TPS™ ELISA与TPS™ IRMA（放射法）、TPS™ EIA（酶法）的相关性>0.99。根据记载的数据，血清中TPS™浓度值采用TPS™ ELISA和TPS™ IRMA的差异为5%，TPS™ ELISA和TPS™ EIA的差异为8%。

说明

本实验数据是按上述实验程序操作获得的。非本公司提供的任何操作程序的修改都将影响实验结果。对此，本公司不承诺任何包括商品性能和适用范围的保证。对此所造成的损失和一系列后果，IDL和它所授权的代理将不负任何责任。

包装材料

本试剂盒所用的包装材料系可回收或燃烧后可转化为自然界物质的材料，皆为环保型材料。