1. 血清必须贮存于-20℃~-70℃,勿长期存放於4℃。对於大体积之包装(例如500ml/瓶),如果一次无法用完一瓶,可将其以40 ml分装于无菌50ml离心管中,由于血清结冻时体积会增加约10%,必须预留此膨胀体积之空间,否则易发生污染或容器冻裂之情形。
2. 一般厂商提供之血清为无菌,不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物,则可将血清加入培养基内一起过滤,勿直接过滤血清。
3. 大体积瓶装(500 ml/瓶)血清解冻步骤 (逐步解冻法):自-20℃或-70℃冰箱取出冷冻瓶装(500ml)之血清,置於4℃冰箱溶解1~2天,然后放在室温下或37℃恒温水槽使其完全溶解后,待全部溶解后再分装。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡),使温度与成分均一,以减少沉淀的发生,勿直接由-70℃放入37℃解冻,因温度改变太大,容易造成蛋白质沉淀物。若血清依正常解冻程序解冻后,仍出现过多沉淀物,则应停止使用,更换另一批号的血清。
4. 小体积(例如40ml)分装之血清可存放于-20℃或-80℃冰箱,使用时直接置於37℃恆温水槽解冻即可,若有少数沉淀物,可将其离心3000 rpm,5分鐘后,去除沉淀物。
5. heat-inactivation是指56℃,30分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement)去活化。除非必须,一般不建议作此热处理,因为会造成沉淀物之显著增多,且会影响血清之品质。
6. 勿将血清置于37℃太久,若在37℃放置太久,血清会变得混浊,同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏,而影响血清之品质。
7. 血清之生长测试
7.1. 前言:血清为细胞培养基之重要添加物,不同厂牌与批号之血清品质差异很大,若要大量购入某类血清,应作适当之选择与筛选,测试血清对细胞生长之影响,然后才引进之。
7.2. 材料:
7.2.1. MDCK cell (ATCC CCL-34或CCRC 60004)或其他细胞株
7.2.2. MEM (minimal essential medium)
7.2.3. 6-well cell culture plate (or 35mm cell culturedish)
7.2.4. methanol
7.2.5. glacial acetic acid
7.2.6. 10% Giemsa solution
7.3. 步骤:
7.3.1. 以MEM with 10% fetal bovine serum(已测试过)培养MDCK细胞于T75flask至80% confluency。
7.3.2. 以trypsin-EDTA处理细胞,离心后,加入适量不加血清之MEM制成细胞悬浮液,并测细胞浓度。以不加血清之MEM稀释细胞浓度为1×102个活细胞数/ ml。
7.3.3. 将1 ml细胞悬浮液接种入6-well cell culture plate中,并另加入1ml含不同浓度的血清(20 % , 10% , 4% , 2% , 1% , 0.4%)之MEM,使血清最终浓度为10% , 5% ,2% , 1% , 0.5% , 0.2%。用已测试过之血清同时进行对照组试验。
7.3.4. 于37℃,5 %CO2培养箱培养5~7天,期间不需更换培养基,待细胞群落大到可以肉眼观察,而群落间不互相接触即可。
7.3.5. 去除培养基,加入1 ml Carnoy's固定液(甲醇体积:冰醋酸体积﹦3:1),室温下静置10min。
7.3.6. 去除固定液,水洗二次。
7.3.7. 加入1 ml 10% Giemsa solution,室温下静置染色2-3 min。
7.3.8. 去除染液,水洗二次。
7.3.9. 以肉眼计数群落数
7.3.10. 计算SPE ( Serum Plating Efficiency ):
SPE = ( No. of colonies / well ) / 100 x 100%
7.3.11. 计算RPE(Relative Plating Efficiency):
RPE =[total colonies of six well (test) / total colonies of sixwell (control) ] x 100%
7.4. 比较各浓度血清培养基之RPE,即可得知待测血清对细胞生长的影响。
7.5. 订购多量同一批号的优良血清,置于-70℃保存之。