1. 前言：
1.1. 欲冷冻保存之细胞应在生长旺盛﹙例如 log phase﹚且存活率高之状态，约为80％ -90％緻密度。
1.2. 冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
1.3. 一般冷冻保护剂为5~10% DMSO。应注意冷冻保护剂之品质，DMSO应為tissueculture等级，无色且无菌﹙以 0.22 micron FGLP Telflonfilter过滤或是直接购买无菌產品﹚。若为大体积包装，将其以少量分装，4℃避光保存，勿作多次冷冻解冻循环。
1.4. 冷冻保存之细胞浓度：1~5 x 106 cells/ml
1.5. 若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backupculture，若冷冻失败，仍有预留之细胞存在。
2. 材料：
2.1. 新鲜培养基
2.2. DMSO
2.3. 无菌塑胶冷冻保存管
2.4. -20℃ 冰箱
2.5. -80℃ 冰箱
2.6. 程式降温机 (可有或无)
3. 步骤：
3.1. 冷冻前应注意细胞生长情形，可在一日前更换半量或全量培养基。
3.2. 配制冷冻保存溶液（使用前配製）：将DMSO加入新鲜培养基中，使其最终浓度为5~10％，混合均匀，置於室温下待用。
3.3. 依细胞继代培养之操作，收集细胞，并取少量细胞悬浮液计数细胞浓度及冻前存活率。
3.4. 将收集之细胞离心1000rpm、5分鐘后，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，混合均匀后，使细胞浓度为1~5 x 106 cells/ml，分装至冷冻保存管中，每管分装 1 ml。
3.5. 冷冻保存方法 1：冷冻管置于 4℃、 10~30分鐘 →移至-20℃、30分鐘** →移至-80℃、16～18小时（或隔夜）→移至液氮槽vapor phase长期储存。
**註：-20℃不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞死亡。亦可跳过此步骤，冷冻管置於厚保丽龙盒内，直接放入-80℃冰箱，但存活率会降低。
3.6. 冷冻保存方法2：冷冻管置於已设定程式之程式降温机中，以每分钟降1~3℃速率降至-80℃以下，然后放入液氮槽之vapor phase长期储存。