一、 冷冻细胞活化︰
1. 收到细胞株冷冻包裹时,请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形,若有解冻情形,请立即通知生资中心。收到细胞株后请儘速开始培养,或先置于-70°C,隔天后再移到液氮保存。
2. 依据细胞株资料单指定之培养基种类、血清种类和其他指定之成份和比例,制备培养基。绝大多数之细胞均无法立即适应不同之基础培养基或不同之血清种类,若因实验需要,必须有所不同时,务必以缓慢比例渐次改变培养基组成,确定细胞适应后,方进行所需之实验。
3. 对细胞而言,fetal bovine serum (胎牛血清)、calf serum (小牛血清) 和horseserum(马血清) 彼此之差异极大,请务必依据细胞株资料单指定之血清种类培养之。
4. 冷冻细胞解冻程序:
4.1 将冷藏之培养基置于 37°C 水槽中回温 (或其他适当之培养温度),回温后以70%ethanol擦拭之, 移入无菌操作台内。自液氮槽或 -80°C 冰箱取出冷冻管,立即放入37°C水槽中快速解冻,水面高度不可接近或高过冷冻管之盖沿,否则易发生污染。轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化后, 以70%ethanol 擦拭冷冻管外部,移入无菌操作台内。
4.2 依据细胞种类和浓度,于无菌操作台内取适量培养基加至适当之培养瓶中。缓慢加入已解冻之细胞悬浮液,与培养基混合均匀后,放入培养箱培养。
5. 对绝大多数细胞而言,1% 以下之冷冻保护剂 (DMSO),不会对细胞之贴附或活化有不良影响,不需立刻由解冻细胞中去除,待第二天确定细胞生长或贴附良好后再去除即可。 惟对极少数因对 DMSO敏感或会造成细胞分化之细胞,需立即去除 DMSO者,则可将解冻后之细胞悬浮液放入 5~10 ml 培养基中,离心 300xg (约1000 rpm),5分钟后,小心移去上清液,加入适量新鲜培养基,将细胞均匀混合后,转移至培养瓶中,再放入培养箱培养。
二、 处理置于 T25 flask 之吸附型细胞︰
1. 于寄送过程中,為避免起泡造成细胞脱落死亡,T25 flask均加满新鲜培养基,同时为避免污染,亦会在寄送前于培养基内添加抗生素 (100 units/ml penicillin + 100μg/mlstreptomycin)。请在收件后检查flask是否有破损或培养基外漏情形,并於显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象,若有异常问题,不要打开盖子,请立即通知食品所生资中心。
2. 将原封之 T25 flask 静置於培养箱中,使细胞回温至 37°C(或其他适当之培养温度),并让运送过程中少数脱落的细胞可再附著生长。隔天后, 於无菌操作台内取出 flask 内之培养基,仅留约5~10 ml 培养基於flask 内,依一般培养方式培养之,若细胞已长满盘,则将细胞做继代培养。
3. 若欲重覆使用上述取出之培养基,则必须注意无菌操作,或再以 0.1 μm 或 0.2 μm 之过滤膜过滤之。
三、 处理置於离心管之悬浮型细胞︰
1. 悬浮型细胞,在培养至足够数量后,通常会分装至 15 ml 离心管以方便运送。
2. 於寄送过程中,为避免污染,会在寄送前於新鲜培养基内添加抗生素 (100 units/ml penicillin+100 μg/mlstreptomycin)。请在收件后检查是否有破损或培养基外漏情形,若有异常问题,不要打开盖子,请立即通知食品所生资中心。
3. 若离心管外观正常,则在无菌操作台内取出培养基与沉淀之细胞,直接置于适当之培养容器内,或加入适量培养基稀释培养,依一般培养方式培养之。