1. 操作原理：
1.1 使用直接培养法，将测试样品接种於适当之微生物培养基中，於培养箱培养后，观察微生物培养基是否產生变化或出现菌落，用以检测细菌与霉菌之污染。
1.2 测试之微生物包括细菌〈好氧与厌氧菌〉、酵母菌与霉菌。
1.3 使用之微生物培养基与测试菌类如表一所示。其中trypticase soybroth、brainheart infusion broth、blood agar及 thioglycollatemedium可以广泛侦测细菌污染，Sabouraud dextrose broth、YM broth 及 nutrient brothwithyeast extract 可以侦测霉菌污染，可依实际需要而选择数种培养基测试之。
表一、微生物培养基种类
培养基 测试菌类
Trypticase soy broth 细菌
Brain heart infusion broth 细菌
Blood agar plate 细菌与厌氧菌
Thioglycollate medium 厌氧菌
Sabouraud dextrose broth 酵母菌与霉菌
YM broth 酵母菌与霉菌
Nutrient broth with 2% yeast extract 细菌,酵母菌与霉菌
YM broth 酵母菌与霉菌
1.4 除了接种至微生物培养基外，亦可以在显微镜下直接观察测试样品是否有微生物污染，或是取样测试样品作染色观察。
2. 材料：
2.1 微生物培养基
2.1.1 Trypticase soy broth
2.1.2 Brain heart infusion (BHI) broth
2.1.3 Blood agar plates
2.1.4 Thioglycollate medium
2.1.5 Sabouraud dextrose broth
2.1.6 YM broth
2.1.7 Nutrient broth with 2% yeast extract
2.2 厌氧缸及厌氧试剂
2.3 附盖玻璃试管〈16 x 100 mm〉
2.4 无菌培养皿
3. 培养基配製：
3.1 Trypticase soy broth (Difco 0370-17-3)：称取 30g粉末溶於1000 ml水中，分装10 ml 至有盖玻璃试管中，高压蒸汽灭菌121℃、15lb、15分钟。
3.2 Brain heart infusion (BHI) broth (Difco 0037-17)：称取37g粉末溶於1000 ml水中，分装10 ml至有盖玻璃试管中，高压蒸汽灭菌121℃、15lb、15分钟。
3.3 Thioglycollate medium (Difco 0256-17-2)：称取29.8 g粉末溶於1000ml水中，加热至沸腾使其完全溶解，分装10 ml至有盖玻璃试管中，高压蒸汽灭菌121℃、15lb、15分钟。
3.4 Sabouraud dextrose broth (Difco 0382-17-9)：称取30 g粉末溶於1000ml水中，分装10 ml 至有盖玻璃试管中，高压蒸汽灭菌121℃、15lb、15分钟。
3.5 YM broth (Difco 0711-01)：称取21 g 粉末溶於1000 ml水中，分装10ml至有盖玻璃试管中，高压蒸汽灭菌121℃、15lb、15分鐘。
3.6 Nutrient broth (Difco 003-01) with 2% yeast extract(Difco0127-01)：称取8 g nutrient broth与20g Bacto yeastextract粉末溶於1000ml水中，分装10 ml 至有盖玻璃试管中，高压蒸汽灭菌121℃、15lb、15分钟。
3.7 Blood agar plates
3.7.1 称取40 g blood agar base(Difco 0045-01)溶於950ml水中，加热使其溶解，高压蒸汽灭菌121℃、15lb、15分钟。
3.7.2 待温度降低至50℃，加入5％(50ml)无菌去凝血纤维之兔血或羊血，混合均匀，分装至培养皿，贮存於4℃。
3.7.3 亦可使用已配製好之培养基：Blood agar plate
(BBL-4321261，trypticase soy agar with 5% sheep blood)
4. 测试样品：
4.1 样品种类包括冷冻细胞、培养中之细胞、测试血清、培养基或其他细胞样品等。若為培养中之细胞，须至少三天以上未更换培养基。若为悬浮型细胞，可直接取样细胞悬浮液。若為吸附型细胞，取样前先吸除大部分培养基，并刮下少许吸附之细胞与剩餘之3-5ml培养基混合后，才进行取样。
4.2 测试样品应不含抗生素，以避免影响测试结果。若测试样品含有抗生素〈例如冷冻细胞或培养细胞〉，则将收集之细胞悬浮液以离心处理或再用不含抗生素之培养基洗涤3次，以移除任何残留之抗生素。
5. 步骤：
5.1 分别接种测试样品至液体微生物培养基与blood agar plate。
5.2 液体微生物培养基：取样约 0.1~1 ml 测试样品，分别接种至2管液体微生物培养基中，然后分别置於37℃ 培养箱与室温〈20℃~30℃〉下培养14~21天。
5.3 Blood agar plate：取样约 0.2 ml 测试样品，分别接种至 2 个agarplate上，其中一个 blood agar plate 置於厌氧缸中，加入厌氧试剂后置於37℃ 培养箱培养14天。另一个bloodagar plate 则直接置于37℃ 培养箱培养14天。
培养基 温度 Gas phase 培养天数(天)
Trypticase soy broth 37℃
26℃ aerobic 14
Brain heart infusion broth 37℃
26℃ aerobic 14
Blood agar plate 37℃
37℃ aerobic
anaerobic 14
Thioglycollate broth 37℃
26℃ aerobic 14
Sabouraud broth 37℃
26℃ aerobic 21
YM broth 37℃
26℃ aerobic 21
Nutrient broth with 2% yeast extract 37℃
26℃ aerobic 21
6. 结果判读：
6.1 阳性反应：
6.1.1 液体培养基：呈现混浊或丝状悬浮物，可在显微镜下观察细菌、酵母菌或霉菌之出现。
6.1.2 blood agar plate：出现菌落。
6.2 阴性反应：液体培养基没有混浊或丝状悬浮物，且 blood agar plate 没有菌落產生。
7. 参考资料：Hay, R.J., Caputo, J., and Macy, M.L. Qualitycontrolmethods for cell lines, second edition. American TypeCultureCollection, Manassas, Virgina.