1. 操作原理：
培养霉浆菌于霉浆菌培养基中，观察菌落之生成。此方法是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其他侦测新步骤之标准步骤之一。缺点为培养时间长，须3~5星期才能判断。且有些霉浆菌不易在目前之培养基中培养出来 (例如 M. hyorhinis)。
2. 材枓：
2.1 霉浆菌培养基
2.1.1 dextrose
2.1.2 L-arginine HCl
2.1.3 Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1)
2.1.4 horse serum (heat-inactivated, 56℃, 30 min)
2.1.5 15% yeast extract solution (autoclaved)
2.1.6 Bacto agar
2.2 阳性反应对照菌株
2.2.1 Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206)
2.2.2 Mycoplasma arginini (ATCC 23838)
2.3 附盖玻璃试管〈16 x 100 mm〉〈已灭菌〉
2.4 6 cm 无菌培养皿
2.5 厌氧缸与厌氧试剂
3. 配制培养基：
3.1 培养基有broth〈液体〉及agar plate〈固体〉二种型式，其基本配方皆为Difco PPLObroth*(60%)、heat-inactivated马血清(20%)、 15% yeast extract solution(10%)、与 10x stock solution (10%)。由於培养时间长，可加入penicillin(最终浓度为500units/ml)至10x stock solution（见3.2）或加入thallium acetate (最终浓度为1：2000)至培养基中（见3.3 与 3.4），以防止其他细菌污染。
*注：亦可使用 Mycoplasma broth base (Becton-Dickison 11458) 或
Mycoplasma agar base (Becton-Dickison 11456)
3.2 10x stock solution (1 liter)
3.2.1 称取 50 g dextrose 和 10 g L-arginine HCl，37℃溶於1 liter蒸馏水中。
3.2.2 以 0.22 μm 无菌过滤膜过滤灭菌。
3.2.3 分装 100 ml至瓶中，保存于 -70℃。
3.3 Mycoplasma broth (1 liter)
3.3.1 称取 21 g 之 Difco PPLO broth，0.02 g phenol red於 600 ml 蒸馏水中，加热搅拌溶解之，灭菌121℃、15 lb、15分钟。
3.3.2 待温度降低至室温后，於无菌操作台内加入 200 ml 之heat-inactivated 马血清，100 ml 之 autoclaved 15% yeast extractsolution，及100 ml 解涷之 10x stock solution，混合均匀后，分装至已灭菌之有盖玻璃试管中，10ml/管。
3.4 Mycoplasma agar (1 liter)
3.4.1 称取 21 g 之 Difco PPLO broth，0.02 g phenolred，15 g Bacto agar* 於 600 ml 蒸馏水中，加热溶解之。 3.4.2. 灭菌121℃，15分钟。
* 注：或用 Difco PPLO agar 取代
3.4.2 灭菌121℃，15分钟。
3.4.3 放在 50℃ 水中浴中，待温度降低至 50℃ 时，於无菌操作台内加入200 ml 之heat-inactivated 马血清，100 ml 之 15% autoclaved yeast extract solution及 100 ml 解冻之 10x stock solution，混合均匀后，倒入无菌培养皿中。
4. 测试样品：
4.1 样品种类包括冷冻细胞、培养中之细胞、测试血清、培养基或其他细胞样品等。若為培养中之细胞，须至少三天以上未更换培养基。若为悬浮型细胞，可直接取样细胞悬浮液。若为吸附型细胞，取样前先吸除大部分培养基，并刮下少许吸附之细胞与剩余之 3~5 ml 培养基混合后，才进行取样。
4.2 测试样品应不含抗生素以避免影响测试结果。若测试样品含有抗生素〈例如冷冻细胞或培养细胞〉，则将收集之细胞悬浮液以离心处理或再用不含抗生素之培养基洗涤3 次， 以移除任何残留之抗生素。
5. 步骤：
5.1 分别接种测试样品至 Mycoplasma broth 与 Mycoplasma agar plate中。
5.2 Mycoplasma broth：取样约 0.1 ml~1 ml 测试样品接种于 Mycoplasmabroth 中，置于 37℃ 培养二週，持续观察是否有混浊或是 pH 值改变之情形。 在培养一週及二週后，分别取样约 0.2 ml 之Mycoplasma broth 接种于Mycoplasma agar plate，将此 agar plate放入厌氧缸中，加入厌氧试剂后置于 37℃ 培养箱培养〈或是使用5% CO2-95% nitrogen之厌氧箱〉，培养至少3星期，持续观察是否有霉浆菌之菌落出现。
5.3 Mycoplasma agar plate：取样约 0.2 ml 测试样品接种于 Mycoplasmaagar plate 上，将此 agar plate 放入厌氧缸中，加入厌氧试剂后置于 37℃ 培养箱培养〈或是使用5%CO2-95% nitrogen 之厌氧箱〉，培养至少3星期，持续观察 agar plate 上是否有霉浆菌菌落出现。
5.4 须作正负反应对照组，正反应对照组为 Acholeplasma laidlawii (ATCC23206) 与 M. arginini (ATCC 23838)。负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。
6. 结果判读：
6.1 阳性反应：Mycoplasma agar plate 上有类似荷包蛋(fried- egglike)之细小菌落产生，可在100倍放大倍率之显微镜下观察。
6.2 阴性反应：Mycoplasma agar plate 上没有菌落产生。
7. 注意事项：
7.1 霉浆菌生长较慢，所以除了接种 Mycoplasma agar plate外，亦同时接种于Mycoplasma broth ，以达增值之作用，于Mycoplasma broth 增殖一及二週后，再转移至agar plate 培 养。需至少培养3星期后，才可断定是否有霉浆菌污染结果，所以整个测试需五个星期才知正确结果。
7.2 典型之霉浆菌菌落类似荷包蛋(fried- egglike)，为圆形无色之细小透明菌落，可藉100倍放大倍率之显微镜观察之。
7.3 若要区分细胞样品造成的类似菌落，可将其自 agar plate上切下，重新培养于液体培养基中，培养一星期后再种入 agar plate，观察菌落之形成，或将其自 agar plate上切下，重新以其他霉浆菌测试〈例如 DNA 萤光染色或 PCR方法〉。
7.4 若有非荷包蛋型之菌落出现，需与其他霉浆菌测试方法比对〈例如 DNA 萤光染色或PCR方法〉，再判定测试结果。
8. 参考资料：Hay, R.J., Caputo, J., and Macy, M.L. Quality controlmethods for cell lines, second edition. American Type CultureCollection, Manassas, Virgina.