1. 操作原理：
1.1 利用萤光染剂（bisbenzimide, Hoechst33258）侦测霉浆菌污染。此染剂会结合到 DNA 之 Adenosine-Thymidine (A-T) rich区域，因为霉浆菌之 DNA 中 A-T含量佔多数（55～80%），所以可将其染色而侦测。被霉浆菌污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之萤光小点。
1.2 测试步骤用间接步骤，将待测细胞悬浮液或细胞培养液接种於指示细胞培养液中（indicator cell，例如 Verocell or 3T6 cell），培养指示细胞后再作萤光染色。正负反应对照组亦可以接种于 indicator cell内作为对照。
1.3 待测细胞亦可培养后直接作萤光染色，但需为吸附型细胞。若有些细胞易有萤光背景，而干扰结果判读，则建议使用1.2之步骤。
2. 材料︰
2.1 试剂
2.1.1 bisbenzimide (Hoechst No.33258, Sigma B-2883)
2.1.2 thimerosol (Sigma T-5125)
2.1.3 Hanks' balanced salt solution without sodium bicarbonate orphenol red
2.1.4 0.1M citric acid
2.1.5 0.2M disodium phosphate
2.1.6 glycerol
2.1.7 glacial acetic acid
2.1.8 methanol
2.2 阳性反应对照菌株
2.2.1 Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206)
2.2.2 Mycoplasma arginini (ATCC 23838)
2.3 chamber slide (Nunc 177380) 或 chamber slide 替代物：在 35or 60mm sterile plate 内放置无菌22 x 22mm盖玻片﹙可将盖玻片浸于酒精内，使用前以过火来灭菌之﹚，一般吸附型细胞均能吸附在盖玻片上。染色后取出盖玻片，细胞面朝下放在玻片上观察。
2.4 指示细胞〈indicator cell〉: Vero (CCRC 60013)
2.5 Vero 细胞培养基：MEM with 10% fetal bovine serum
2.6 萤光显微镜：激发滤镜〈excitation filter〉波长為340-380nm，阻断滤镜〈barrier filter〉波长为430 nm。
3. 试剂配制:
3.1 无菌HBSS︰Hanks' balanced salt solution 以0.22 um无菌过滤膜过滤后才使用之。
3.2 Hoechst 33258 stock solution（50 ug/ml, 100X stocksolution）︰
称取5.0 mg bisbenzimide 和 10.0 mg thimersol 溶于 100 ml无菌HBSS，置於棕色瓶中，室温下以电磁搅拌器搅拌30-45分鐘至完全溶解后，以 1 ml小体积分装，贮存於-20℃。此染剂对光与热敏感，所以应置于棕色瓶中并以铝箔纸包覆，并于低温保存。
3.3 Hoechst 33258 working reagent（0.5 ug/ml）︰
取1 ml Hoechst 33258 stock solution〈见3.2〉，加入sterile 100 mlHBSS中，室温下搅拌30-45分鐘，置於棕色瓶中并以铝箔纸包覆，避免光照，贮存于4℃。
3.4 mounting solution︰混合 22.2 ml 0.1 M citric acid、27.8 ml 0.2M disodium phosphate 和 50 ml glycerol，调整 pH 至 5.5，贮存于4℃。
3.5 固定溶液（fixative）︰冰醋酸与甲醇以1︰3之体积比例混合，使用前才配制。
4. 测试样品：
4.1 样品种类包括冷冻细胞、培养中之细胞、测试血清、培养基或其他细胞样品等。若為培养中之细胞，须至少三天以上未更换培养基。若为悬浮型细胞，可直接取样细胞悬浮液。若为吸附型细胞，取样前先吸除大部分培养基，并刮下少许吸附之细胞与剩于之 3~5 ml 培养基混合后，才进行取样。
4.2 测试样品应不含抗生素以避免影响测试结果。若测试样品含有抗生素〈例如冷冻细胞或培养细胞〉，则将收集之细胞悬浮液以离心处理或再用不含抗生素之培养基洗涤3 次， 以移除任何残留之抗生素。
5. 步骤：
5.1 培养Vero细胞：
5.1.1 于测试前一周培养 Vero 细胞。或 Vero细胞可作长期培养或製作多个冷冻保存管，测试前再解冻培养。
5.1.2 在接种测试样品前一日，以 trypsin-EDTA 溶液处理 Vero 细胞，制成细胞悬浮液，以1~2 x 104 cells／ml 培养于 chamber slide中，每个 well 加入 1 ml 细胞悬浮液，于37℃,5％CO2培养。隔日确定生长良好后，即可接种测试样品。
5.2 接种测试样品：
5.2.1 将 0.2~0.5 ml 之测试样品加入chamber slide 内，培养5天，进行Hoechst 33258 的萤光染色观察。
5.2.2 测试之细胞亦可直接接种于 chamber slide 或 coverslip上，亦培养5天以上不更换培养基，然后进行萤光染色。
5.2.3 以 Acholeplasma laidlawii ATCC 23206 感染 Vero细胞作为正反应对照组﹙或是已感染霉浆菌之细胞培养液或冷冻细胞悬浮液﹚，负反应对照组为 Vero cell 之新鲜培养基(MEM +10% FBS)。
6. DNA萤光染色检测*︰
6.1 取出培养 5-6 日之 Vero 细胞，吸除旧培养液。
6.2 于每个 well 中加入 2 ml 之 1:3 体积混合的冰醋酸/甲醇固定液，室温下静置 10 min后，吸除固定液。重复此步骤 2 次。在加入与吸除固定液期间，勿让 culture dry。
6.3 风干10分钟。
6.4 于每个 well 中，加入1 ml Hoechst 33258 working solution，室温下静置 30min。
6.5 吸掉 Hoechst 33258 染液后，以无菌水洗涤3次，风干后加入1滴的 mountingsolution，并以盖玻片覆盖之。
6.6 以 100 倍至 400 倍萤光显微镜观察，激发滤镜〈excitation filter〉波长為340-380nm，阻断滤镜〈barrier filter〉波长为430 nm。观察细胞核外是否有蓝色萤光小点或是丝状点之萤光物產生。
*注： 测试之细胞亦可直接接种于 chamber slide 或 coverslip 上，其固定与染色方法同上。
7. 结果判读︰
7.1 阳性反应：
除了细胞核会呈现蓝色萤光外，在与细胞表面与细胞核外会出现蓝色萤光小点或是丝状点，其萤光点很小且形状一致，与细胞核残片染成之不规则之较大点状物不同，且其萤光维持较久，可维持数星期。若仍无法判读，可在1000 倍显微镜下观察以区分之。
7.2 阴性反应：
只出现细胞核之蓝色萤光点，在细胞核外与细胞表面没有蓝色萤光小点或丝状点。
(A) 阴性反应
(B) 阳性反应
8. 注意事项︰
8.1 测试样品之细胞悬浮液在接种至 Vero细胞后，可能会发生凋亡〈apoptosis〉现象，而產生许多细胞核碎片干扰结果判读。 若发生此状况，必须有经验之人员判读。
8.2 若细胞固定步骤或染色后之洗涤步骤处理不好，则可能出现萤光背景，细胞质亦被染色，而干扰结果判读，可用无菌水洗涤数次，或静置数日待萤光背景减弱后，再观察之。
9. 参考资料：Hay, R.J., Caputo, J., and Macy, M.L. Quality controlmethods for cell lines, second edition. American Type CultureCollection, Manassas, Virgina.